PERKECAMBAHAN IN VITRO

LAPORAN PRAKTIKUM KJT

PERKECAMBAHAN IN VITRO

                                                           

                                                            Disusun Oleh :

                                                            Nama      : HIRMAN

                                                            NIM        : 10640005

                                                      

                         

LABORATORIUM TERPADU

PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA

YOGYAKARTA

2013

PERKECAMBAHAN IN VITRO

I.  TUJUAN

1.1. Melakukan kerja aseptis dengan menumbuhkan biji secara In Vitro

1.2. Memperoleh sumber explant yang steril

II. DASAR TEORI

      Kultur jaringan/Kultur In Vitro/Tissue Culture adalah suatu teknik untuk mengisolasi, sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik,sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.

      Menurut Gunawan (1988), arah pertumbuhan dan perkembangan atau regenerasi eksplan ditentukan oleh beberapa faktor yaitu: komposisi media serta jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh, bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan dan lingkungan tempat eksplan dikulturkan. Medium yang digunakan untuk membiakan potongan jaringan tersebut mengandung makanan berupa unsur – unsur hara makro dan mikro. Penggunaan eksplan dari jaringan muda lebih sering berhasil karena sel-selnya aktif membelah, dinding sel tipis karena belum terjadi penebalan lignin dan selulose yang menyebabkan kekakuan pada sel.

      Gunawan (1995) menyatakan bagian tanaman yang dapat digunakan sebagai eksplan adalah : pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon, hipokotil. Menurut Wattimena (1992) perbedaan dari bagian tanaman yang digunakan akan menghasilkan pola pertumbuhan yang berbeda. Eksplan tanaman yang masih muda menghasilkan tunas maupun akar adventif lebih cepat bila dibandingkan dengan bagian yang tua.

      Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyaratan untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan (Mahmoudzadeh and Kruif ,1992).
         Unsur makro dan mikro digunakan dalam bentuk senyawa garamnya. Sedangkan vitamin yang berfungsi untuk pertumbuhan umumnya dari kelompok vitamin B (B1, B6 dan B12). Pembentukan embrio somatik atau penggandaan tunas memerlukan zat pengatur tumbuh dari jenis sitokinin dan auksin. Medium yang digunakan dapat berupa cairan atau padatan dengan menambahkan agar. Media dalam botol yang berisi potongan jaringan kemudian ditempatkan dalam ruang dengan suhu dan kelembapan ruang nisbi yang terkontrol (berAC), dengan pencahayaan 12 jam per hari yang berasal dari lampu neon dengan intensitas cahaya antara 3.000 – 10.000 luks (Mahmoudzadeh and Kruif ,1992).

      Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senyawa organik yang bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung (promote), menghambat dan merubah proses fisiologi tumbuhan (Abidin, 1995). Auksin dan sitokinin adalah zat pengatur tumbuh yang sering ditambahkan dalam media tanam karena mempengaruhi pertumbuhan dan organogenesis dalam kultur jaringan dan organ.

      Menurut Wattimena (1992) auksin sintetik perlu ditambahkan karena auksin yang terbentuk secara alami sering tidak mencukupi untuk pertumbuhan jaringan eksplan. Auksin mempunyai peranan terhadap pertumbuhan sel, dominasi apikal dan pembentukan kalus. Kisaran konsentrasi auksin yang biasa digunakan adalah 0,01 – 10 ppm.

      Naphthalene Acetic Acid (NAA) adalah auksin sintetik yang sering ditambahkan dalam media tanam karena mempunyai sifat lebih stabil daripada Indol Acetic Acid (IAA). Menurut Hendaryono dan Wijayani (1994) IAA dapat mengalami degradasi yang disebabkan adanya cahaya atau enzim oksidatif. Oleh karena sifatnya yang labil IAA jarang digunakan dan hanya merupakan hormon alami yang ada pada jaringan tanaman yang digunakan sebagai eksplan. Sedangkan NAA tidak mudah terurai oleh enzim yang dikeluarkan sel atau pemanasan pada proses sterilisasi.
      Sitokinin adalah zat pengatur tumbuh yang berperan dalam mengatur pembelahan sel serta mempengaruhi diferensiasi tunas pada jaringan kalus. Menurut Mariska et al., (1987) Benzyl Adenine (BA) merupakan zat pengatur tumbuh sintetik yang daya rangsangnya lebih lama dan tidak mudah dirombak oleh sistem enzim dalam tanaman. BA dapat merangsang pembentukan akar dan pembentukan tunas.
Penambahan auksin dan sitokinin secara kombinasi telah berhasil dilakukan terhadap beberapa spesies tanaman.

      Welander (1997) dalam Asmirda (1993) membuktikan bahwa rasio NAA dan BA yaitu 10 : 1 efektif untuk induksi tunas dan akar Begonia sp. Wijono dalam Prahardini dan Sudaryono (1992) membuktikan bahwa penambahan 3 mg/l NAA dan 2 mg/l BA efektif untuk induksi kalus pepaya dan jumlah kultur perkalus meningkat dengan peningkatan NAA dari 1 mg/l – 3 mg/l.

      Berdasarkan kebutuhan zat pengatur tumbuh untuk pembentukan kalus, maka dalam media tanam perlu ditambahkan auksin dan sitokinin. Interaksi kedua zat ini mempengaruhi pertumbuhan, morfogenesis dalam kultur sel, kultur jaringan dan organ. Konsentrasi dari kedua zat pengatur tumbuh ini sering mengendalikan bentuk dan jumlah pertumbuhan suatu kultur, baik pertumbuhan kalus atau organogenesis. Sehubungan dengan hal tersebut, perlu dilakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui respon eksplan daun tanaman jeruk manis secara invitro akibat pemberian NAA dan BA.

III.  METODE

3.1. Alat dan Bahan

         Alat yang digunakan pada praktikum perkecambahan in vitro ini yaitu Botol berisi kapas steril, Petridisk berisi kertas saring steril, Pinset, Lampu Bunsen, Penggaris, Pipet, Erlenmeyer 50 ml, 100 ml, Hand sprayer berisi spiritus, laminar air flow, glove, dan masker.

         Sedangkan bahan yang digunakan yaitu Biji kacang hijau (Vigna radiate), Biji Sawi (Brasicca sp), Medium MS ½ tanpa ZPT, Akuades steril, Bleach 5,25 % Na Hipoklorit, Alkohol 70%, Tissue dan Detergen cair/ tween 20.

3.2. Cara Kerja

Sterilisasi biji sawi dan biji kacang hijau:

3.2.1. Biji di cuci dengan merendamnya kedalam air yang telah ditambahkan beberapa tetes detergen cair dalam gelas beaker. Diaduk-aduk dengan menggunakan tangan atau shaker selama 2-3 menit.

3.2.2. Dicuci dalam air mengalir selama 15 menit.

3.2.3. Eksplan direndam dalam alcohol 70 % selama 1-2 menit, diangkat kemudian direndam dalam larutan natrium hipoklorit 2% + 2-3 tetes Tween selama 15 menit.

3.2.4. Dalam ruang steril, eksplan dibilas dengan akuades steril sebanyak 5 kali, masing-masing selama 1 menit.

3.2.5. Eksplan ditanam kedalam media kultur, masing-masing botol 3 biji.

3.2.6. Botol ditutup dengan alumunium foil, diberi label dan disimpan didalam ruang kultur.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1.      Tabel 1. Hasil pengamatan kecambah pada Vigna radiata

No.	Pengamatan hari					Ket.
	0	5	10	15	20
1.	-	4	5	5	5	Tidak ada kontaminan, tumbuh lebat.
2.	-	3	3	3	3	Hari ke-5, baru imbibisi, ke-10 tumbuh akar.
3.	-	3	3	3	3	Hari k-5 biji berimbibisi, hari-10 sampai terakhir tumbuh, tidak ada kontaminan
4.	-	3	3	3	3	Hari k-5 biji berimbibisi, hari-10 sampai terakhir tumbuh, tidak ada kontaminan
5.	-	3	3	3	3	Hari k-5 biji berimbibisi, hari-10 sampai terakhir tumbuh, tidak ada kontaminan
6.	-	3	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, hari ke-10 sudah tumbuh daun
7.	-	3	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, hari ke-10 sudah tumbuh daun
8.	-	3	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar
9.	-	2	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar
10.	-	2	2	2	2	Hari ke-5 berimbibisi, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar
11.	-	4	4	4	4	Hari ke-5 berimbibisi, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar
12.	-	3	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar
13.	-	1	3	3	3	Hari ke-5 berimbibisi, tumbuh tunas dulu, sampai hari ke-20 daun tumbuh dan banyak akar

4.1.2. Tabel 2. Hasil pengamatan kecambah pada Brasicca sp

No	Pengamatan hari					Ket.
	0	5	10	15	20
1	-	9	10	10	10	2 tidak tumbuh, warna hijau muda
2	-	8	8	8	8	1 tidak tumbuh, warna hijau muda
3	-	8	8	8	8	Tumbuh semua, warna hijau muda
4	-	3	4	4	4	Tumbuh semua, warna hijau muda
5	-	3	4	4	4	Tumbuh semua, warna hijau muda
6	-	4	4	4	4	Tumbuh semua, warna hijau muda
7	-	5	6	7	7	Tumbuh semua, warna hijau muda
8	-	9	9	9	9	Tumbuh semua, warna hijau muda
9	-	4	4	4	4	Tumbuh semua, warna hijau muda
10	-	3	4	4	4	Hari ke-10 terkontaminasi oleh jamur tapi tetap tumbuh
11	-	3	3	3	3	Tumbuh semua, warna hijau muda
12	-	4	4	4	4	Tumbuh semua, warna hijau muda
13	-	4	6	6	6	Tumbuh semua, warna hijau muda

4.2. Pembahasan

         Praktikum KJT kali ini berjudul perkecambahan In Vitro yang bertujuan supaya praktikan mampu melakukan kerja aseptis dengan menumbuhkan biji secara In Vitro dan memperoleh sumber eksplan yang steril. Eksplan yang digunakan pada praktikum ini adalah biji kacang hijau (Vigna radiata) dan biji sawi (Brasicca sp) serta medium yang digunakan yaitu medium ½ MS.

         Dari hasil pengamatan pada tabel 1. diatas dapat kita lihat bahwa pertumbuhan kecambah Vigna radiata mengalami pertumbuhan yang subur dibuktikan dengan hasil pengamatan dari hari ke 5 sebagian besar tumbuh semua biji hingga pada hari ke 20 mengalami pertumbuhan yang lebat baik dilihat pada pertumbuhan akar maupun daun dan batang. Hal ini bisa terjadi karena media yang digunakan cocok untuk tanaman tersebut. Pada hari ke 5 ada beberapa biji saja yang belum tumbuh akan tetapi mengalami imbibisi. Daun dan akar rata-rata tumbuh pada hari ke 10 dan tidak terdapat adanya kontaminasi.

         Pada tabel 2. Dapat kita lihat pada kecambah Brasicca sp juga mengalami pertumbuhanyang tidak jauh berbeda dengan Vigna radiata namun ada beberapa biji saja yang tidak mengalami pertumbuhan atau bisa dikatakan mengalami dormansi biji. Hal itu bisa terjadi karena disebabkan oleh beberapa faktor baik yang berasal dari internal biji itu sendiri maupun yang berasal dari eksternal. Selepas dari hal itu, kebanyakan dari biji sawi mengalami perkecambahan semua dari hari kelima sampai dengan hari ke 20 yaitu kecambah berwarna hijau muda. Pada perkecambahan sawi terdapat satu botol yang mengalami kontaminasi yaitu dikontaminasi oleh jamur, akan tetapi walaupun terkontaminasi masih bisa tumbuh. Kontaminasi bisa terjadi karena bisa jadi ketika menanam praktikan tidak berhati-hati dalam meminimalisir sumber kontaminan. Sumber kontamin bisa berasal dari eksplan, alat, bahan atau pun bisa berasal dari praktikan itu sendiri. Oleh karena itu pada saat menanam diharuskan semua dalam keadaan steril.

         Jika kita bandingkan laju pertumbuhan pada kecambah kacang hijau dan sawi maka pada tabel dapat kita lihat bahwa perkecambahan biji sawi lebih cepat tumbuh daripada biji kacang hijau. Padahal jika kita lihat kulit biji sawi lebih keras disbanding dengan kacang hiajau. Hal ini bisa terjadi karena biji sawi mampu menyerap air atau nutrien dengan cepat.

         Pada praktikum ini menggunakan media ¹/₂ MS karena terkait dengan faktor pertumbuhan eksplan yang pada masa imbibisi membutuhkan air yang cukup banyak. Dengan adanya air yang cukup memadai maka eksplan akan dengan cepat akan mengalami pertumbuhan.

                     Faktor yang menentukan keberhasilan kultur jaringan tumbuhan adalah media dan zat pengatur tumbuh. Medium yang digunakan untuk membiakkan biji tersebut mengandung makanan berupa unsur-unsur hara makro dan mikro. Disamping itu , ke dalam medium juga ditambahkan sumber karbon yang berasal dari sukrosa dan gula,vitamin dan zat pengatur tumbuh yang berfungsi untuk memacu pertumbuhan dan meningkatkan kemampuan sel untuk menjadi calon tanaman atau planlet (Dixon and Gonzales, 1994).

V. KESIMPULAN

      Praktikan sudah mampu menerapkan cara kerja yang aseptis dengan menumbuhkan biji secara In vitro, hal ini dibuktikan dari hasil yang diperoleh biji sawi dan biji kacang hijau mampu tumbuh dengan subur dan lebat pada media ¹/₂ MS.

      Dengan hasil penanaman yang begitu lebat maka praktikan telah berhasil pula membuat sumber eksplan yang baru dan dalam keadaan steril (eksplan steril) yang akan digunakan untuk menumbuhkan individu baru dari salah satu organ dari eksplan steril tersebut.

      DAFTAR PUSTAKA

Abidin, Z. 1985. Dasar – Dasar Tentang Zat Pengatur Tumbuh. Angkasa: Bandung
Asmirda. 1993. Respon Pertumbuhan Potongan Jaringan Daun Jeruk Nipis (Citrus Aurantifolia)   pada Medium Murashige dan Skoog dengan Penambahan 2,4 – D, NAA dan BA. Tesis Sarjana Biologi Universitas ANdalas: Padang
Gunawan, I.W. 1988. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laborartorium Kultur Jaringan PAU. Bioteknologi. IPB: Bogor
Gunawan, I.W. 1995. Teknik In vitro Dalam Hortikultura. Penerbit Swadaya: Jakarta
Hendaryono, D.P.S dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur jaringan Perbanyakan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif. Kanisius: Yogyakarta
Jumin, H.B. 1997. Perkembangan Baru Dalam Breeding Citrus Suatu Tinjauan Bioteknologi. UIR Press. Pekanbaru.
Rukmana, R dan Y. Yuniarsih. 2003. Usaha Tani Jeruk Keprok. Aneka Ilmu. Semarang
Suryowinoto, M. 1996. Pemuliaan Tanaman Secara In Vitro. Kanisius. Yogyakarta.
Wattimena, G.A. 1992. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman. Laboratorium Kultur Jaringan PAU Bioteknologi. IPB. Bogor

 Gambar 1. Hari Ke-20

 Gambar 2. Hari ke-15

 Gambar 3. Hari ke-10

 Gambar 4. Hari ke-5

Gambar 5. Pengamtan