H!RM4N AR R4$Y4D: INDUKSI KALUS (DAUN SAWI DAN KOTILEDON KEDELAI)

LAPORAN PRAKTIKUM KJT

INDUKSI KALUS
(DAUN SAWI DAN KOTILEDON KEDELAI)

Disusun Oleh :

Nama : HIRMAN

NIM : 10640005

KLPK : II

Asisten : Maidatun Nafi’ah, S.Si

LABORATORIUM TERPADU

PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SUNAN KALIJAGA

YOGYAKARTA

2013

INDUKSI KALUS
(DAUN SAWI DAN KOTILEDON KEDELAI)

I. TUJUAN

1.1. Mengamati respon kultur jaringan daun dan hipokotil sawi (Brassica sp) dan kotiledone kedelai terhadap kombinasi zat pengatur tumbuh

1.2. Mengamati pembentukan kalus pada daun dan hipokotil Brassica sp dan kotiledone kedelai.

II. DASAR TEORI

Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali. Konsep awal dari kultur jarngan adalah diketahuinya kemempuan totipotensi dari sel tumbuhan. Totipotensi sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi tanaman lengkap.

Kultur Jaringan adalah teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utamanya adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Teknik kultur jaringan pada saat ini telah berkembang menjadi teknik perkembangbiakan tanaman yang sangat penting pada berbagai spesies tanaman (Iswanto,2002).

Lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan yang akan digunakan dalam proses kultur.

a. Sterilisasi Ruang

Bagian dalam laminar air flow disemprot dengan alkohol 70%. Kemudian lampu ultraviolet (UV) dinyalakan selama 1 jam. Saat akan digunakan, lampu neon dan kipas dinyalakan (Zulkarnain, 2009).

b. Sterilisasi Alat

Alat-alat dissecting set dan glass ware yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung, sedangkan mulut botol ditutup dengan alumunium foil. Selanjutnya alat-alat disterilisasi di dalam autoclaf dengan suhu 121°C selama 15 menit. Proses inokulasi eksplan, alat-alat dissecting set disterilisasi dengan alkohol 96% dan dibakar dengan nyala api spiritus setiap kali akan digunakan di laminar air flow (Santoso, 2003)

c. Sterilisasi Media

Media yang digunakan adalah media Murashige and Skoog atau MS (lampiran 1) di masukkan ke dalam botol kultur dan disterilisasi dengan autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit (Suryowinoto, 1996).

d. Sterilisasi Eksplan

Sterilisasi permukaan eksplan daun terdiri dari 2 tahap sterilisasi yaitu sterilisasi tahap I yang dilakukan di ruang persiapan dan sterilisasi tahap II yang dilakukan di laminar air flow. Sterilisasi tahap I meliputi: Daun tembakau muda (daun ketiga sampai kelima dari pucuk) diambil dari green house dibilas dengan air mengalir hingga bersih. Sedangkan sterilisasi tahap II dilakukan setelah sterilisasi tahap I, meliputi: Daun direndam dalam larutan etanol 70% selama 25 detik, kemudian dibilas dengan aquades steril selama 5 menit, Kemudian dibilas dengan aquades steril selama 5 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya eksplan diambil dengan pinset dan ditiriskan pada cawan petri yang berisi kertas saring (George,1993).

Ada beberapa jenis ZPT yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman, namun efisiensi dan efektivitasnya berbeda terhadap jenis tanaman yang berbeda. Sebagai contoh, kinetin sangat efektif untuk kultur buku batang), sementara sitokinin konsentrasi rendah dapat memacu perkembangan tunas sedangkan konsentrasi tinggi merangsang penggandaan tunas. Auksin pada konsentrasi rendah dapat memacu pertumbuhan akar dan pada konsentrasi tinggi dapat merangsang pertumbuhan kalus. Dengan demikian, pengaturan zat pengatur tumbuh di dalam media sangat menentukan terhadap keberhasilan pertumbuhan dan perkembangan kultur. Dalam perbanyakan tanaman dibutuhkan pemilihan perbandingan konsentrasi auksin, sitokinin dan suplemen yang tepat, karena hal ini akan menentukan dalam derajat keberhasilan pembentukan tanaman baru (Nurwahyuni dan Elimasni,2006).

Kultur jaringan merupakan suatu teknik isolasi bagian tanaman, seperti jaringan, organ atau embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril sehingga bagian tanaman tersebut mampu bergenerasi dan berdiferensiasi menjadi tanaman lengkap (Winata, 1987 dalam Zulkarnain, 2009). Metode kultur jaringan dapat menghasilkan tanaman baru dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat, dimana tidak bergantung pada musim. Keunggulan lain dari kultur jaringan yaitu memperoleh sifat fisiologi Kultur Jaringan Tembakau dan morfologi sama persis dengan tanaman induknya (Hendaryono dan Wijayani, 1994). Sehingga penyediaan bibit akan selalu terpenuhi dan bibit yang akan disebar ke masyarakat bersifat persis dengan tanaman induknya (Desriatin, 2004)

Teknik kultur jaringan tumbuhan atau kultur in vitro dapat dijadikan sebagai alternatif pemecahan masalah bagi perbanyakan bibit dan perolehan metabolit sekunder dari tanaman ini. Teknik ini dapat menghasilkan metabolit sekunder dalam jaringan tanaman dan juga dalam sel-sel yang dipelihara pada media buatan secara aseptik (Fitriani, 2003). Metabolit sekunder bisa diperoleh melalui kultur kalus. Metabolit yang dihasilkan dari kalus sering kali kadarnya lebih tinggi dari pada metabolit yang diambil langsung dari tanamannya. Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk meningkatkan pertumbuhan kalus adalah dengan menambahkan pra zat ke dalam media. Media kultur jaringan tumbuhan berisi garam-garam mineral, hormon, vitamin, sumber karbon, dan asam amino. Smith (1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam tanaman (Sitorus, et al.,2011).

III. METODE

3.1. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu Petridisk steril, Pinset, Gelas beacker, Scalpel dan Lampu Bunsen. Sedangkan bahan yang digunakan yaitu Daun sawi, Hipokotil Alkohol 70 %, Akuades dan Medium kultur + ZPT.

3.2. Cara Kerja

3.2.1. Disiapkan medium MS padat dengan zat pengatur tumbuh yang dikombinasikan (BA, NAA, 2,4 D)

3.2.2. Alat dan bahan steril serta media disiapkan diruang LAF

3.2.3. Eksplan daun dan hipokotil sawi steril serta kotiledone kedelai diambil dari botol

3.2.4. Dipilih daun dan kotiledone yang bagus dan semua sisi daun sawi di lukai

3.2.5. Daun dan hipokotil serta kotiledone yang sudah dilukai, ditanam pada media yang sudah disediakan

3.2.6. Setelah ditanam, botol ditutup dengan aluminium foil dan ujung botol dibungkus dengan scapel

3.2.7. Diamati perubahan yang terjadi pada eksplant setiap hari ke 0, 5, 10, 15 dan 20

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

Tabel 1. Induksi kalus pada daun sawi hari ke-5

No.		Kalus		Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
No.		Warna	Tekstur	Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
1	A	-	-	-	-	-	Stagnan
	B	-	-	-	-	-	Stagnan
	C	Bening	Padat	-	-	-
2	A	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	B	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	C	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
3	A	Putih	Kompak	+	-	-
	B	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
	C	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
4	A	Putih	Kompak	-	-	-	Belum kontam
	B	Putih	Kompak	-	-	-	Belum kontam
	C	putih	Kompak	-	-	-	Belum kontam
5	A	-	-	-	-	-	-
	B	-	-	-	-	-	-
	C	Bening	Kompak	-	-	-
6	A	Hijau	Padat	-	-	-	No kontam
	B	Bening	Kompak	+	-	-	kontam
	C	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
7	A	-	-	-	-	-	Daun membentang
	B	-	-	-	-	-	Daun membentang
	C	-	-	-	-	-	Daun membentang
8	A	-	-	-	-	-	-
	B	-	-	-	-	-	-
	C	-	-	-	-	-	-
9	A
	B	-	-	-	-	-	Daun membentang
	C	Hijau	Padat	-	-	-	Daun membentang
10	A			-	-	-	No kontam
	B	-	-	-	-	+
	C	-	-	-	-	+

Tabel 2. Induksi kalus pada daun sawi hari ke-10

No.		Kalus		Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
No.		Warna	Tekstur	Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
1	A	-	-	-	-	-	Stagnan
	B	-	-	-	-	-	Stagnan
	C	Bening	Padat	-	-	-
2	A	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	B	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	C	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
3	A	Putih	Kompak	+	-	-
	B	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
	C	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
4	A	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
	B	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
	C	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
5	A	Bening hijau	Kompak	-	-	-
	B	Bening hijau	Kompak	-	-	-
	C	Bening hijau	Kompak	-	-	-
6	A	Hijau	Padat	+	-	-	Kontam
	B	Hijau muda	Kompak	+	-	-	Kontam
	C	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
7	A	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	B	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	C	-	-	-	-	-	stagnan
8	A	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	B	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	C	-	-	-	-	+	-
9	A	-	-				Daun membentang
	B	-	-	-	-	-	Daun menggulung
	C	Hijau	Padat	-	-	-	No kontam
10	A	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam
	B	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam
	C	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam

Tabel 3. Induksi kalus pada daun sawi hari ke-15

No.		Kalus		Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
No.		Warna	Tekstur	Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
1	A	-	-	-	-	-	Stagnan
	B	-	-	-	-	-	Stagnan
	C	Bening	Padat	-	-	-
2	A	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	B	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
	C	-	-	+	-	-	Medium kontam jamur
3	A	Putih	Kompak	+	-	-
	B	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
	C	-	-	+	-	-	Daun membentang, stagnan
4	A	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
	B	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
	C	Putih	Kompak	-	+	-	Medium kontam
5	A	Bening hijau	Kompak	-	-	-
	B	Bening hijau	Kompak	-	-	-
	C	Bening hijau	Kompak	-	-	-
6	A	Hijau	Padat	+	-	-	Kontam
	B	Kuning	Kompak	-	-	-	No Kontam
	C	Hijau muda	Kompak	-	-	-	No kontam
7	A	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	B	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	C	-	-	-	-	-	stagnan
8	A	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	B	Hijau muda	Padat	-	-	-	No kontam
	C	-	-	-	-	+	-
9	A	-	-				Daun membentang
	B	Hijau	Padat	-	-	-	No kontam
	C	Hijau	Padat	-	-	-	No kontam
10	A	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam
	B	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam
	C	Hijau tua	Kompak	-	-	-	No kontam

Tabel 4. Induksi kalus pada kotiledon kedelai hari ke 5 sampai hari ke-20

No.		Kalus		Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
No.		Warna	Tekstur	Jamur	Bakteri	Browning	keterangan
1	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	Bening	Padat	-	-	-	No kontam
2	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	-	No kontam
3	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
4	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-		+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
5	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
6	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
7	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-		-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
8	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam
9	A	-	-	-	-	+	No kontam
	B	-	-	-	-	+	No kontam
	C	-	-	-	-	+	No kontam

4.2. PEMBAHASAN

Pembentukan kalus diawali dengan terjadinya pembengkakan pada permukaan eksplan. Pembengkakan ini disusul dengan terbentuknya kalus pada pinggir daun atau bigagian tulang daun, karena pertulangan daun merupakan daerah penyalur makanan ke seluruh bagian permukaan daun sehingga sel yang terdapat dekat pertulangan daun dapat membelah dan membentuk kalus (Lizawati et al. 2012). Proses terjadinya disebabkan adanya rangsangan luka, rangsangan tersebut menyebabkan ketidakseimbangan pada dinding sel berubah arah, sebagian protoplas mengalir keluar sehingga mulai terbentu kalus. Terbentuknya kalus juga disebabkan sel-sel kontak dengan media terdorong menjadi meristematik dan selanjutnya aktif mengadakan pembelahan seperti jaringan penutup luka (Suryowinoto. 1996).

Dalam praktikum ini menggunakan eksplan daun sawi dan kotiledon dari kedelai. Hal ini dimaksudkan untuk membandingkan hasil induksi antara costae yang memiliki kambium dan jaringan meristematis dengan lamina yang mengandung klorofil dan dapat membentuk kalus pada daun. Sebelum dilakukan sterilisasi dilakukan tahap pre sterilisasi, yaitu pencucian dengan menggunakan sabun cair. Hal ini dilakukan untuk mengurangi kotoran pada daun dan kotiledon. Kemudian dicucui kembali dengan alkohol 70% yang sebagai dehidrator.

Hasil pengamatan selama 20 hari pada eksplan daun sawi menunjukkan bahwa, secara umum mengalami perubahan pada hari ke-5. Dari segi warna kalusnya ada yang bening, hijau muda, putih dan hijau. Sedangkan teksturnya yaitu kompak dan padat, eksplan juga membentang. Pada hari tersebut juga terdapat ekspaln yang terkontaminasi oleh jamur. Namun ada 2 botol yang mengalami browning (pencoklatan), terkontaminasi jamur terdapat 7 botol dan terkontaminasi oleh bakteri terdapat 3 botol eksplan. Namun beberapa botol eksplan juga belum menunjukkan pertumbuhannya.Sehingga pertumbuhannya ada yang stagnan. Pada hari ke-10, warna kalus dan teksturnya masih sama ketika hari ke-5 namun jumlah eksplan yang tumbuh semakin banyak. Begitu pula pada hari ke-15 sampai hari ke-20 hasil menunjukkan hal yang sama, jika ada perubahan baik dari segi warna, tekstur kalus pada tiap botol eksplan tidak jauh beda saat hari sebelumnya.

Hasil pengamatan pada kotiledon kedelai selama 20 hari yaitu warna dan teksturnya bening dan padat. Hasil yang didapat pada eksplan ini kurang memuaskan karena hampir semua eksplannya tidak menunjukkan adanya pertumbuhan kalus. Sebaliknya semua eksplan justru mengalami browning.

. Perbandingan kecepatan kalus yang tumbuh, pada eksplan daun sawi kalus lebih cepat tumbuh dari pada eksplan kotiledon kedelai. Hal ini dapat dikarenakan untuk kedelai lebih lama proses nutrisi yang masuk atau karena eksplan yang digunakan kualitasnya kurang bagus. Beberapa eksplan tidak dapat membentuk kalus, hal ini dikarenakan karena adanya perbedaan kemampuan jaringan menyerap unsur hara dan zat pengatur tumbuh dalam media induksi kalus tersebut Selain itu eksplan yang tidak membentuk kalus mengalami perubahan warna dari hijau menjadi coklat kemudian mati. Hal ini dapat disebabkan karena timbulnya senyawa fenolik yang keluar dari eksplan tersebut (Lizawati et al. 2012). Asam-asam fenolik bersama dengan asam absisat (ABA) merupakan inhibitor endogen yang menghambat terbentuknya kalus (Wattimena. 1988).

Pencoklatan jaringan terjadi melaui aktivitas enzim oksidasi (mengandung Cu) seperti polifenoloksidase yang dibebaskan atau disintesis dalam kondisi oksidatif ketika ekspaln terluka. Sunstrat untuk enzim ini bervariasi namun secara umum berupa o-hidroksifenol. Enzim dan substarnya biasanya berada dalam lokasi yang berbeda didalam sel, dan bercampur ketika sel terluka (George dan Sherrington. 1986). Toksisitas fenol disebabkan karena senyawa ini membentuk ikatan hidrogen dengan protein yang irreversibel. Penghambat pertumbuhan yang tidak dapat diperbaiki lagi, terjadi ketika fenol teroksidasi enjadi senyawa kuinon yang amat aktif. Senyawa ini lalu mensiklase, polimerse dan mengoksidasi protein untuk membentuk senyawa melanin, penyebab warna hitam (Wijayani. 1993).

Hal yang dapat mencegah browning dengan menghilangkan senyawa fenolik, memodifikasi potensial redoks, menginaktifkan enzim fenooksidase, serta dengan mnegurangi aktivitas fenol (Daisy. 1994). Fenol sering dikonotasikan sebagai zat penghambatyang harus dihilangkan dari kultur in vitro. Berbagaimetode untuk menghindari pembentukan fenoltelah dilakukan, dan yang paling umum adalah denganmentransfer eksplan ke media baru. Tetapi peningkatanjumlah subkultur seringkali menyebabkanakumulasi mutasi sel-sel dan menyebabkan hilangnyasel yang efektif untuk membentuk embriogenesis. Penambahanarang aktif ke dalam media kultur seringkalidapat menghindari pembentukan inhibitor fenolat(Hutami 2006). Arang aktif menghilangkan pewarnaandengan menyerap dan mengoksidasi fenol dan menginaktifkanperoksidase. Arang aktif juga dapat menyerap eksudasi beracun dan menyerap adanya inhibitor pertumbuhan seperti senyawa fenolik. Arang aktif bersifat sebagai adsorben karena mempunyai pori-pori yang banyak dan permukaan yang luas, sehingga mampu menyerap berbagai zat beracun. Arang aktif mengurangi pencoklatanpada eksplan palem dan kultur media(Tisserat 1979), sehingga memacu eksplan untuk tumbuhsecara organogenesis.

Kecenderungan senyawa menjadi teroksidasi atau tereduksi tergantung pada oksidasi-reduksi (redoks) potensial dari suatu larutan. Senyawa pereduksi yang redoks potensialnya rendah seperti asam askorbat sangat efektif untuk menghindari pencoklatan dari isolasi jaringan tanaman atau ekstrak tanaman dan sering diasumsikan bahwa hal tersebut menghambat oksidasi fenol (George dan Sherrington 1984). Oksigen yang tidak larut meningkatkan redoks potensial larutan dan menyebabkan oksidasi lebih cepat. Reduksi sementara dengan mengisolasi eksplan segar pada oksigen dapat membantu menghindari terjadinya pencoklatan (Sri Hutami. 2008).

Senyawa penkhelat atau pengikat selain mempunyai kemampuan mengikat unsur/senyawa lain juga dapat mengganggu aktivitas enzim peroksida (Weinstein etal. 1951 dalam George dan Sherrington 1984) menemukan bahwa EDTA dapat menghambat aktivitas polifenol oksidase pada daun bunga matahari yang dikulturkan secara in vitro, dan disimpulkan bahwa senyawa khelat menghilangkan metal esensial untuk aktivitas enzim oksidase. NaFeEDTA dan EDTA keduanya dapat menghilangkan penghitaman pada tunas pucuk Carex dan Simth (1968) menyatakan bahwa hal tersebut terjadi karena pengikatan tembaga yang dibutuhkan dalam pembentukan enzim fenolase, ketika dia menemukan bahwa agen pengikat/penkhelat dapat melindungi pencoklatan dari isolat segar tunas pucuk dari Carex flacca. Beberapa reaksi oksidatif juga dikatalisir secara biokimia oleh ion-ion seperti Cu++, Co++, dan Zn++.

Tingkat oksidasi fenol dapat dikurangi dengan pengurangan aktivitas enzim spesifik atau pengurangan substrat untuk oksidasi. Aktivitas oksidasi polifenol tertinggi pada pH 6,5 dan menurun pada pH lebih rendah (Ichihashi dan Kako 1977 dalam George dan Sherrington 1984). Perendaman eksplan pada campuran asam askorbat dan asam sitrat tidak hanya mengekspose eksplan pada senyawa reduksi tetapi juga pada pH rendah. Huang etal. (2002) melaporkan bahwa aktivitas PPO sejajar dengan pencoklatan eksplan pada bambu. Pencoklatan tertinggi diperoleh dari medium dengan pH 8, di mana pH tersebut konsisten dengan pH optimum enzim pada bambu. Stabilitas PPO tertinggi pada bambu pada pH 10.

V. KESIMPULAN

1. Induksi kalus pada dun sawi dan kotiledon kedelai dilakukan pada medium MS 0 dan MS 2,4-D.

2. Induksi kalus lebih efektif pada bagian daun dibandingkan pada bagian kecambah atau kotiledon. Kontaminasi lebih banyak terjadi pada eksplan daun sawi.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Daisy. 1994. Budidaya Jaringan Bawang Putih (Allium sativum L.)

George, E.F. and P.D. Sherrington 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. Hand Book and Directory of Comercial Laboratories. Eastern Press, Reading, Berks.England. p. 9-449

Hendaryono dan Ari wijayani. 2012. Teknik Kultur Jaringan Pengenalan dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif Modern. Penerbit Kanisius: Yogyakarta

Huang, L.C., Y.L. Lee, B.L. Huang, C.I. Kuo, and J.F.Shaw. 2002. High Polyphenol Oxidase Activity And LowTitratable Acidity In Browning Bamboo Tissue Culture. InVitro Cell. Dev. Biol. Plant

Hutami, S. 2006. Penggunaan Arang Aktif Dalam Kultur InVitro. Berita Biologi

Iswanto, H. 2002. Petunjuk Perawatan Anggrek. Jakarta: AgroMedia Pustaka.

Lizawati, Neliyati dan Retna Deasfira. 2012. Induksi Kalus Eksplan Daun Durian (Durio Zebethinus Murr. cv. Selat Jambi) Pada Beberapa Kombinasi 2,4-D dan BAP

Luri, Sepdian. 2009. Kultur Kalus.

Suryowinoto. 1996. Budidaya Jaringan dan Manfaatnya. Fakultas Biologi. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta

LAMPIRAN